Vita sintetica: fatta da zero

Perché dotare gli organismi di funzioni innaturali richiede una migliore comprensione della biologia, delle proteine ​​del progettista e della ricerca dell'anima.

Gocce di olio in acqua, un approccio comune per la creazione di

La biologia sintetica è una disciplina scientifica che mira a progettare razionalmente gli organismi viventi, in genere con approcci di ingegneria genetica (1). Nel 1961, Francois Jacob e Jacques Monod proposero per la prima volta che i circuiti regolatori genetici dirigono il comportamento cellulare (2). Nel 2000, gli scienziati hanno progettato con successo circuiti genetici innaturali, li hanno impiantati in microrganismi e i circuiti hanno svolto la loro funzione specificata. I primi esempi includono l'interruttore genetico a levetta (3), in cui due promotori guidano l'espressione di repressori che si inibiscono reciprocamente, causando la "commutazione" cellulare tra stati stazionari e il repressore (4), che è emerso nello stesso anno.

I circuiti genetici si ispirano ai circuiti elettrici e sono costruiti secondo principi simili, da Geralt Pixabay.

Oggi l'applicazione di metodologie ingegneristiche alla modifica razionale degli organismi è un obiettivo persistente della biologia sintetica. La maggior parte dei biologi sintetici descrive l'ingegneria biologica come una gerarchia, in cui parti (geni, DNA) vengono utilizzate per costruire dispositivi (molti geni insieme), che a loro volta possono essere utilizzati per costruire sistemi (una serie di molti dispositivi) (1). La sfida nel trasformare la biologia sintetica in una vera disciplina ingegneristica è che le parti, che sono i mattoni elementari delle costruzioni di ordine superiore, sono fondamentalmente limitate dal rigore della loro caratterizzazione. Questo è davvero il caso di tutte le discipline ingegneristiche consolidate. Nell'ingegneria elettrica, ad esempio, i componenti di base (transistor, resistori, fili, ecc.) Sono stati caratterizzati così bene che i bambini possono usarli e i circuiti risultanti si comportano come previsto. Una volta che tutte le "parti" sono standardizzate, potrebbe essere possibile per i biologi sintetici utilizzare i singoli elementi costitutivi del DNA per costruire forme di vita interamente sintetiche dal basso verso l'alto.

Busto di Aristotele. Fotografia di morhamedufmg Pixabay.

L'idea della vita sintetica esiste da millenni. Aristotele, nel IV secolo a.C., scrisse sulla generazione spontanea nel suo libro "Sulla generazione di animali", che affermava che la carne in decomposizione produceva forme di vita completamente nuove. Nel XX e XXI secolo sorsero gravi preoccupazioni etiche che circondavano le forme di vita artificiale. Nel 2005, il virus T7 del batteriofago è stato "rifattorizzato" con successo sostituendo 11.515 coppie di basi di DNA con una forma sintetica e mantenendo la vitalità delle particelle virali (5). Due anni dopo, J. Craig Venter riuscì a trapiantare cromosomi tra microrganismi (6) e, l'anno successivo, pubblicò un genoma artificiale completo basato su M. genitalium (7). Nel 2010, i componenti sono stati riuniti insieme e un genitalium M. contenente un genoma "sintetico" è stato costruito con successo (8).

Un progetto internazionale in corso chiamato Synthetic Yeast 2.0 sta tentando di costruire il primo organismo eucariotico in possesso di un genoma sintetizzato chimicamente (9). L'esempio più ambizioso della costruzione del genoma sintetico fino ad oggi, ogni istituto membro sta costruendo e risolvendo uno dei 16 cromosomi del lievito. Nei prossimi anni, sperano di produrre un lievito completamente "sintetico" che possieda tutti questi cromosomi sintetizzati chimicamente.

L'anno scorso, il gruppo Romesberg presso lo Scripps Research Institute ha pubblicato la creazione di una "forma di vita semi-sintetica", che ha fornito la prima prova di un microrganismo con nucleotidi sintetici nel suo genoma (chiamato X e Y), il cui codice era trascritto e tradotto con successo, espandendo così gli amminoacidi disponibili per le cellule viventi da 20 a 172 (10). Romesberg è stato attento nel trasmettere i suoi risultati ai media, affermando: "Non lo definirei una nuova forma di vita - ma è la cosa più vicina che qualcuno abbia mai fatto" (11).

Lo sforzo più vicino oggi per costruire qualcosa che può davvero essere chiamato vita sintetica è il consorzio Build-a-Cell, che mira a costruire cellule sintetiche da zero utilizzando componenti modulari. Teoricamente, una cellula che possiede tutti i geni necessari per il metabolismo di base, la divisione cellulare, la segnalazione e alcuni altri compiti potrebbe essere considerata viva e costruita interamente da blocchi ben caratterizzati.

Ma per quanto riguarda lo sviluppo di organismi che possiedono funzionalità completamente nuove - quelle che non si trovano da nessuna parte in natura? Come possono i biologi sintetici passare oltre il ricablaggio dei componenti esistenti (che è stato raggiunto solo in parte) e spostarsi nel regno delle incognite? Ci sono molte sfide che limitano questa transizione, ma alla fine accadrà. Una forma di vita artificiale, che si basa solo vagamente su un organismo esistente, può essere costruita solo se il suo sviluppatore ha una comprensione completa di come funziona la vita e può prevedere come si comporterà ciascun componente all'interno della cellula. Poiché le proteine ​​sono uno dei mezzi più importanti con cui una cellula svolge le sue funzioni, è ovvio che una migliore comprensione della funzione proteica e la capacità di progettare proteine ​​con funzioni completamente nuove, potrebbero facilitare questa transizione.

Esistono tre "sfide" principali nello sviluppo di forme di vita sintetiche con nuove funzionalità. Sebbene gli esempi forniti qui non siano in alcun modo esaustivi, comprendono gli aspetti scientifici, tecnologici ed etici.

Sfida scientifica: funzioni proteiche sconosciute

La biologia sintetica è una disciplina che si basa su progressi paralleli in genomica, biologia molecolare e computazione. Per progettare gli organismi in modo prevedibile, è necessario comprendere con fermezza le loro complessità, differenze e, soprattutto, la funzione di ciascun componente, prima che i componenti possano essere riorganizzati e trapiantati a piacimento. Questa è la sfida scientifica.

Per trovare un esempio convincente delle lacune esistenti e lampanti nelle conoscenze scientifiche che devono essere affrontate prima di creare di nuovo la vita, non è necessario guardare oltre gli sforzi per costruire un genoma minimo, completato nel 2016, in cui il genoma di Mycoplasma mycoides era ridotto a soli 473 geni (12). È forse sorprendente che questo sforzo sia stato preceduto, nel 2012, dalla creazione di un modello di cellula intera, basato sul semplice organismo Mycoplasma genitalium, dal gruppo di Markus Covert a Stanford (13). Nonostante la semplicità di questi organismi (il genitalium nativo ha solo 525 geni) e gli intensi sforzi scientifici dedicati alla loro comprensione, 149 geni essenziali in M. mycoides hanno una funzione sconosciuta (12).

Un limite fondamentale nella costruzione di forme di vita sintetiche è che il metodo principale per condurre la ricerca biologica, storicamente, è stato quello di isolare o eliminare i geni in modo indipendente e quindi identificare la loro funzione all'interno della cellula. Questo approccio è utile, ma può essere imperfetto per indagare su tutte le funzioni complesse in cui è coinvolto, in quanto “… un singolo componente (come un gene) raramente controlla in modo specifico una particolare funzione o malattia biologica, e al contrario qualsiasi dato componente può influenzare molte funzioni diverse ”(1). Per capire come i componenti all'interno dell'ambiente cellulare svolgono le loro funzioni, gli approcci biochimici canonici richiedono tempo e sono laboriosi, ma possono rimanere una necessità. Tuttavia, sono stati usati altri approcci a livello di sistema per prevedere la funzione dalla sequenza.

Nei mesi successivi alla pubblicazione di Venter di una cellula vitale e minimale, Antoine Danchin e Gang Fang hanno predetto alcune delle funzioni geniche sconosciute tramite analisi evolutiva, scorrendo attraverso la letteratura per determinare i geni essenziali che svolgono funzioni di base nelle lame batteriche correlate che non sono state menzionate come uno dei geni noti nei micoidi del genoma minimo (14). Usando queste relazioni evolutive, Danchin e Fang hanno proposto identità per 32 dei 149 geni sconosciuti (14). Ma la cellula minima (e il suo predecessore) non sono gli unici organismi relativamente semplici che sono stati ampiamente studiati e le relazioni evolutive non sono l'unico modo per studiare la funzione delle proteine. I ricercatori del lievito hanno cercato a lungo nuovi metodi per determinare la funzione di geni sconosciuti. Nel 2007, c'erano oltre 1000 geni non caratterizzati nel lievito (15).

Una cosa è eseguire l'omologia o analisi evolutive su grandi serie di dati, ma un'altra è isolare la proteina in questione ed eseguire studi enzimatici o eliminare il gene in vivo per studiarne gli effetti. Con i geni essenziali, la cancellazione è più difficile da ottenere risultati, ma ci sono ancora opzioni disponibili per studiare le funzioni delle proteine, come il monitoraggio del fluoroforo, le immunoprecipitazioni, l'immunoblotting e gli inibitori farmacologici. Sebbene richieda tempo e laborioso, forse un approccio biochimico basato su strumenti comprovati è ancora il metodo migliore per determinare la funzione.

Una volta determinata la funzione di ciascun componente, il passaggio successivo consiste nell'utilizzare approcci a livello di sistema per capire come funzionano nel più ampio contesto cellulare. Questo è il lavoro dei biologi dei sistemi, che “cercano di capire come tutti i singoli componenti di un sistema biologico interagiscono nel tempo e nello spazio per determinare il funzionamento del sistema. Permette di comprendere la grande quantità di dati provenienti dalla biologia molecolare e dalla ricerca genomica, integrati con una comprensione della fisiologia, per modellare la complessa funzione di cellule, organi e interi organismi ”(16). Oggi, una comprensione limitata della funzione proteica ostacola gravemente la costruzione della vita sintetica.

Sfida tecnologica: prevedere la funzione dalla sequenza

In futuro, sarebbe utile creare cellule che svolgano uno scopo su misura, anche se tale scopo richiede una funzione enzimatica o un comportamento che non si trova in nessuna parte della natura. Con i progressi nella previsione della struttura e della funzione delle proteine ​​dalla sequenza del DNA, la "modularità" delle parti che un giorno potrebbero essere utilizzate per costruire organismi biologici dal basso verso l'alto verrà espansa drasticamente. Mentre alcuni gruppi di ricerca stanno lavorando alla creazione di proteine ​​con funzioni completamente nuove, tra cui il gruppo del premio Nobel Frances Arnold 2018, una migliore comprensione della funzione proteica e strumenti per ingegnerizzare in modo affidabile la struttura proteica sono disperatamente necessari. Una delle maggiori sfide tecnologiche legate alla creazione di organismi completamente "innaturali" è: quali metodi possono essere usati per costruire proteine ​​con nuove funzionalità e in che modo siamo vincolati?

Il "problema del ripiegamento delle proteine" è stato affrontato da molti gruppi, forse nessuno famoso come David Baker all'Università di Washington. Il gruppo di Baker è noto (in parte) per lo sviluppo di ROSETTA e ROSETTA @ Home, un programma di previsione della struttura proteica, e la sua versione per uso domestico, in cui le persone al loro personal computer possono lavorare per risolvere la struttura energetica più bassa per una varietà di proteine (17). Baker ha anche creato una società spin-out, chiamata Arzeda, che utilizza piattaforme di previsione strutturale per la creazione di enzimi con nuove funzionalità che possono essere utilizzate per applicazioni ambientali, diagnostiche e terapeutiche (20).

Programmi computazionali sviluppati dal gruppo Baker e altri sono stati usati per progettare una piega proteica assolutamente unica non presente in natura (18) e per progettare interfacce proteina-proteina per applicazioni nella progettazione terapeutica (19). Ma una delle attuali limitazioni nella progettazione di strutture biologiche completamente nuove è la potenza di calcolo. Le simulazioni ab initio in genere sondano e testano molti stati proteici conformazionali per identificare strutture con la più bassa energia libera (20, 21). Nel 2009, un supercomputer all'avanguardia potrebbe simulare una proteina di 50 residui, atomo per atomo, per 1 millisecondo. Da allora questa capacità è stata superata dai personal computer (22, 23).

Sfortunatamente, la previsione della funzione proteica da una sequenza di DNA è molto più complessa della previsione della struttura proteica. La capacità di prevedere le funzioni proteiche potrebbe consentire la progettazione rapida e razionale delle proteine ​​con attività completamente nuove. Il gruppo di Frances Arnold presso il California Institute of Technology affronta questo problema utilizzando il "più potente processo di progettazione biologica, l'evoluzione, per ottimizzare gli enzimi esistenti e inventarne di nuovi, aggirando così la nostra profonda ignoranza sul funzionamento della sequenza". L'evoluzione è così grande strumento per sviluppare nuove proteine, in parte perché le mutazioni necessarie per implementare una nuova utile funzione sono spesso altamente non intuitive. Sebbene la maggior parte degli aminoacidi responsabili della specificità o selettività del substrato si trovino nel sito attivo, alterazioni degli aminoacidi distanti dal sito attivo possono anche portare ad attività catalitiche drasticamente migliorate (24).

Un culmine di approcci che comprendono il calcolo, la progettazione e l'evoluzione hanno maggiori probabilità di riuscire a creare proteine ​​sempre più complesse in base alla progettazione.

Sfida etica e sociale

L'etica della biologia sintetica è stata fortemente contestata dai primi rapporti sui circuiti genetici pubblicati nei primi anni 2000 e il rapporto di un genoma sintetizzato chimicamente nel 2010 ha spinto l'amministrazione Obama a creare una commissione di bioetica per affrontare le nuove capacità della biologia sintetica ( 25). Durante questa iniziativa, gli etici hanno affermato che, se gli scienziati dovessero riuscire a creare l'organismo, la vita stessa potrebbe perdere il suo status speciale (26). In altre parole, le persone inizierebbero a vedere la vita come nient'altro che una serie di intricate reazioni biochimiche che possono essere replicate in laboratorio e la creazione di un organismo sintetico riduzionista minerebbe questo status speciale.

L'argomentazione morale riduzionista contro la creazione della vita sintetica è anche collegata al riduzionismo metodologico, una strategia che le discipline ingegneristiche hanno sfruttato per ridurre sistematicamente i componenti per comprendere ulteriormente come è costruito il tutto. Questo è il caso della standardizzazione nella biologia sintetica, in cui ogni componente è caratterizzato individualmente e, tuttavia, non vi è stato alcun contraccolpo etico rispetto alla standardizzazione biologica sistematica. Questi sono, tuttavia, gli stessi principi riduzionisti che consentiranno l'eventuale creazione di una forma di vita sintetica. Infine, non ci sono prove che suggeriscano che i precedenti sforzi per costruire la vita semi-sintetica, menzionati precedentemente in questo articolo, e gli organismi con genomi sintetici, abbiano in qualche modo danneggiato lo status speciale che gli umani attribuiscono agli organismi viventi nonostante l'attenzione dei media.

Tuttavia, ci sono punti etici chiave da considerare prima che vengano costruite le forme di vita sintetiche. Le linee guida formulate da Weitze e Pühler sono particolarmente approfondite (27). Innanzitutto, gli scienziati hanno tutte le conoscenze pertinenti e una comprensione globale della tecnologia in questione? Solo perché gli scienziati possono costruire qualcosa non significa che dovrebbero. Di conseguenza, gli scienziati dovrebbero lavorare per una piena comprensione (ove possibile!) Dei principi biologici in gioco all'interno dell'organismo in modo da prevenire o mitigare potenziali problemi.

Devono essere presi in considerazione anche i potenziali svantaggi di un nuovo organismo sintetico. Le persone spesso usano la tecnologia in modi inaspettati, quindi è importante che le potenziali applicazioni dell'organismo sintetico vengano discusse in modo proattivo. Le normative governative e le considerazioni etiche devono essere tenute in considerazione molto prima dell'inizio della costruzione effettiva.

Il quadro di ricerca e innovazione responsabile, sviluppato dall'EPSRC (Engineering and Physical Sciences Research Council, la principale agenzia di finanziamento del Regno Unito per l'ingegneria e le scienze fisiche), prevede che la ricerca sulla biologia sintetica venga condotta utilizzando AREA, che sta per Anticipate, Reflect , Engage and Act (28). I ricercatori dovrebbero esplorare a fondo l'impatto del proprio progetto di ricerca prima di intraprenderlo, riflettere sugli scopi per svolgere la ricerca, impegnarsi con persone al di fuori della propria disciplina, compresi i bioeticisti, e quindi agire su questi processi e modellare la direzione della propria ricerca progetto di conseguenza.

Nei decenni a venire, verranno progettate e costruite celle con funzionalità completamente uniche e innaturali. I progressi compiuti oggi sono il trampolino di lancio verso questo obiettivo più grande e possono inaugurare una nuova era della biologia sintetica, in cui gli organismi vengono realizzati ad hoc per affrontare alcuni dei problemi più urgenti del mondo.

Riferimenti

1. "Biologia sintetica: portata, applicazioni e implicazioni". La Royal Academy of Engineering. Maggio 2009. Accesso al 2 dicembre 2017.

2. Jacob F e Monod J. “Meccanismi regolatori genetici nella sintesi delle proteine.” Journal of Molecular Biology 3, 318–356 (1961).

3. Gardner TS, Cantor CR e Collins JJ. "Costruzione di un interruttore genetico a levetta in Escherichia coli". Natura 403, 339–342 (2000).

4. Elowitz MB e Leibler S. “Una rete oscillatoria sintetica di regolatori trascrizionali.” Natura 403, 335–8 (2000).

5. Chan LY, Kosuri S ed Endy D. “Refactoring batteriofago T7.” Mol Syst Biol 1 (2005).

6. Lartigue C, Glass JI, Alperovich N, et al. "Il trapianto di genoma nei batteri: cambiare una specie in un'altra." Science 317, 632–8 (2007).

7. Gibson DG, Benders GA, Andrews-Pfannkoch C, et al. "Sintesi chimica completa, assemblaggio e clonazione di un genoma di Mycoplasma genitalium." Science 319, 1215–20 (2008).

8. Gibson DG, Glass JI, Lartigue C, et al. “Creazione di una cellula batterica controllata da un genoma sintetizzato chimicamente.” Science 329, 52–6 (2010).

9. Annaluru N, Muller H, Mitchel LA, et al. "Sintesi totale di un designer funzionale cromosoma eucariotico." Science 344, 55–8 (2014).

10. Zhang Y, Ptacin JL, Fischer EC, et al. "Un organismo semi-sintetico che memorizza e recupera maggiori informazioni genetiche." Nature 551, 644–47 (2017).

11. "Gli scienziati creano il primo organismo semi-sintetico che immagazzina e recupera informazioni innaturali". Comunicato stampa dello Scripps Research Institute. 29 novembre 2017. Accesso al 2 dicembre 2017.

12. Hutchison CA, Chuang R, Noskov VN, et al. "Progettazione e sintesi di un genoma batterico minimo." Science 351, 1414 (2016).

13. Karr JR, Sanghvi JC, Macklin DN, et al. "Un modello computazionale a cellule intere predice il fenotipo dal genotipo." Cella 150, 389–401 (2012).

14. Danchin A e Fang G. “Incognite sconosciute: geni essenziali nella ricerca della funzione.” Microb Biotechnol 9, 530–40 (2016).

15. Peña-Castillo L e Hughes TR. "Perché ci sono ancora oltre 1000 geni di lievito non caratterizzati?" Genetica 176, 7–14 (2007).

16. "Systems Biology: A Vision for Engineering and Medicine." Academy of Medical Sciences e Royal Academy of Engineering (2007).

17. Kaufmann KW, Lemmon GH, DeLuca SL, Sheehan JH e Meiler J. “Praticamente utile: cosa può fare per te la Suite di modellizzazione proteica ROSETTA.” Biochimica 49, 2987–98 (2010).

18. Kuhlman B, Dantas G, Ireton GC, Varani G, Stoddard BL e Baker D. “Progettazione di una nuova piega proteica globulare con precisione a livello atomico.” Science 302, 1364–68 (2003).

19. Ashworth J, Havranek JJ, Duarte CM, et al. "Riprogettazione computazionale del legame con il DNA dell'endonucleasi e specificità di scissione". Nature 441, 656–59 (2006).

20. Jiang L, Althoff EA, Clemente FR, et al. “Progettazione computazionale de novo degli enzimi retro-aldol.” Science 319, 1387–91 (2008).

21. Simons KT, Bonneau R, Ruczinski I e Baker D. "Predizione della struttura proteica ab initio degli obiettivi CASP III mediante Rosetta". Proteine ​​37, 171–76 (1999).

22. Shaw DE, Bowers KJ, Edmond C, et al. "Atti della conferenza su reti informatiche ad alte prestazioni, archiviazione e analisi - SC" 09 ". (2009).

23. Pierce LCT, Salomon-Ferrer R, de Oliveira CAF, et al. "Accesso di routine agli eventi su scala temporale di millisecondi con dinamica molecolare accelerata." J Chem Theory Comput 8, 2997–3002 (2012).

24. Tracewell CA e Arnold FH. "Evoluzione diretta degli enzimi: l'arrampicata fitness raggiunge un aminoacido alla volta." Curr Opin Chem Biol 13, 3–9 (2009).

25. Pollack A. "Stati Uniti La Commissione di Bioetica dà il via libera alla biologia sintetica. ”The New York Times. 16 dicembre 2010.

26. Cho MK, Magnus D, Caplan AL e McGee D. "Considerazioni etiche nella sintesi di un genoma minimo". Science 286, 2087–89 (1999).

27. Weitze M e Pühler A. "Biologia sintetica: verso una scienza ingegneristica". Rassegna europea 22, S102-12 (2014).

28. "Framework for Responsible Innovation". Consiglio di ricerca in ingegneria e scienze fisiche.